单效浓缩器操作方法-启派智能装备

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单效浓缩器操作方法

浏览 1194次发布时间:2024-05-09 

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怎样浓缩液体

主要是两种办法。蒸馏分常压蒸馏和减压蒸馏,后者一般用于沸点较高的溶剂的去除。另外,实验室常用的浓缩方法是旋转蒸发,在旋转蒸发仪上进行操作,也属于减压蒸馏的原理。在没有条件或条件不太好的地方,建议使用减压蒸馏的方法进行浓缩。对于无机物溶液浓缩,蒸发皿蒸发是常用的方法。

PT-PCR操作流程

是RT-PCR啊。一、实验器具与材料: 1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头:1ml、200μl、20μl 3、匀浆管:5ml 4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个 5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖) 1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇) 7、量筒:50ml、250ml、500ml 8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml 9、试管架:5ml、1.5ml、20μl 10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水 11、铝制饭盒:4个 12、塑料小饭盒:1个 13、大瓷缸:2个 14、锡泊纸:一卷 15、卷纸:2卷 16、三角烧瓶:带盖,稍大 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等) 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管) 2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干) 3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC) 三、试剂配制: 1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压) 3、异丙醇:放入棕色瓶中 4、氯仿:放入棕色瓶中 5、琼脂糖 四、几种缓冲液的配制: 1、电泳缓冲液: Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml? pH8.0 蒸溜水 1000ml 5×TBE (贮存液) 再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液 450ml水–→500ml工作缓冲液 2、上样缓冲液: 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×缓冲液,4℃保存 五、琼脂糖凝胶的配制: 1、1.0%: 1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。 2、1.5%: 同上,将琼脂糖的量改为1.5g六、需购置的Rt-PCR材料: (生工. Tel. 2236106.) Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00 dNTP: 1支 oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer) RNasin: 1支 110 — -20℃ DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies — 4℃ Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威 (1543. 994. 697. 515. 377. 231) 七、引物合成 正义:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′ 反义:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′ 2、par-4: 正义:5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′ 反义:5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′ 3、退火温度计算 2(A T) 4(G C) 正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃) 4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好 5、引物稀释: 加DEPC水量为(μl) = ? nmol / OD × 管上所标OD数×100 是为10p mol / μl 浓度的引物溶液 八、PCR产物电泳 先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。 九、几个注意点: 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴? 2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。 3、RNA抽提前,打开离心机预冷。 TRIzol法抽提总RNA 细胞1×107 组织100mg ↓ 加1mlTRIzol 细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓ 匀浆(要彻底,后转至EP管) (组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管) ↓ 颠倒混匀10下,室温5分钟 ↓ 加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5) ↓ 颠倒混匀10下,室温5分钟 ↓ 4℃,离心12000g,15分钟 ↓ 转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中 ↓ 加等体积异丙醇(约400μl),混匀室温10分钟 ↓ 4℃,离心12000g,10分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)1ml ↓ 4℃离心7500g,5分钟 ↓ 弃上清,空气干燥5-10分钟(不能完全干燥) ↓ 溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl) (可在55-60℃水中,<10分钟助溶)注: 1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中,否则DEPC溶解 2、细胞组织加TRIzol匀浆后,可在-60℃放置至少一个月(甚至可一年以上) 3、RNA在75%乙醇中,2-8℃至少可保存一周,-20℃至少可保存一年 两步法RT-PCR (第一步:逆转录反应) 试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23μl(11.5μl) Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl (稀释10倍后用) ↓ 混匀,离心,70℃ 5min ↓ 立即冰水浴,稍离心 ↓ 试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1× dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U 总体积40μl(20μl) ↓ 混匀,离心,42℃ 60min ↓ 95℃ 10min(破坏MLV) ↓ 4℃保存 两步法RT-PCR (第二步:PCR反应) 总体积20μl(50μl) 试剂 浓度 体积 终浓度 Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1× MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM 上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol 下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol cDNA模板 X (?) (1-10μl) DEPC水 20μl-4.3μl-XTaq酶 2.5U/μl 0.3μl (1μl) 2.5U/μl ↓ 混匀 ↓ 97℃,5分钟 ↓ 立即冰水浴 ↓ 混匀 ↓ 95℃ 5分 预变性 94℃ 30秒 变性 X℃ 40秒 退火 72℃ 30秒 延伸 72℃ 7分 终末延伸 28-36循环,4℃保温 三、电泳: 加1-10μl PCR产物 溴芬兰(1-2.5μl)混匀,加样,电泳。 注意:Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存,操作时置于冰上。DNTP勿反复冻融。

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